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先把蛋白稀釋一定的倍數,比如說(shuō)10倍、20倍稀釋?zhuān)ㄟ@樣可以大體確定一個(gè)參數),將抗原進(jìn)行一系列稀釋包被微量反應板,再用一定稀釋度的陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清進(jìn)行孵育后洗滌,再加酶結合物進(jìn)行反應,經(jīng)孵育洗滌后,加底物溶液顯色,終止反應后分別測定o.d值,選擇o.d值≥1.0的那個(gè)抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個(gè)o.d值稍大于1.0,而不選擇小于1.0的抗原濃度。陰性參考血清o.d值要求<0.1-0.2。也就是要求陽(yáng)性參考血清和陰性參考血清的o.d值有明顯差別。
在ELISA試劑盒實(shí)驗血清為什么要稀釋?zhuān)坑袃蓚(gè)原因:
1.競爭抑制比較明顯,應稀釋競爭物;
2.血清中含有的性腺激素比較低,應該濃縮才對。
ELISA試劑盒血清標本的保存建議有以下幾點(diǎn):
1.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染,一則細菌的生長(cháng),其所分泌的一些酶可能會(huì )對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì )對用相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
2.血清標本如是以無(wú)菌操作分離,則可以在2~8℃下保存一周,ELISA如為有菌操作,則建議冰凍保存。樣本的長(cháng)時(shí)間保存,應在-70℃以下。
3.冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而引起假陰性結果。此外,凍融標本的混勻亦應注意,不要進(jìn)行劇烈振蕩,反復顛倒混勻即可。
4.要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團,其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性,因此,在以HRP為標記酶的測定中,如血清標本中血紅蛋白濃度較高,則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應顯色。
5.標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí),應離心沉淀后取上清檢測。
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